La tinció de Gram és una tècnica ràpida i s’utilitza per veure la presència de bacteris en una mostra de teixit i classificar els bacteris com a Gram-positius o Gram-negatius, en funció de les propietats químiques i físiques de les seves parets cel·lulars. La tinció de Gram s’utilitza quasi sempre com a primer pas per diagnosticar una infecció bacteriana.
Aquesta tècnica de tinció porta el nom del científic danès Hans Christian Gram (1853 - 1938), que va desenvolupar la tècnica el 1882 i la va publicar el 1884 com a tècnica per distingir dos tipus de bacteris amb símptomes clínics similars: Streptococcus pneumoniae (també conegut com Streptococcus pneumoniae) i els bacteris Klebsiella pneumoniae.
Pas
Mètode 1 de 3: Preparació de la diapositiva del microscopi
Pas 1. Prepareu-vos per treballar al laboratori
Utilitzeu guants i una corbata llarga per evitar la contaminació bacteriana de la mostra que esteu provant. Netejar l’espai de treball sota una campana de fum, o en una altra zona ben ventilada. Comproveu el cremador Bunsen i assegureu-vos que el microscopi funciona correctament abans de començar.
Pas 2. Esterilitzeu la diapositiva de vidre del microscopi
Si el portaobjectes de vidre està brut, renteu-lo amb aigua sabonosa per eliminar l’oli i la brutícia. Netegeu les làmines amb etanol, netejador de vidres o un altre mètode utilitzat pel vostre laboratori.
Pas 3. Col·loqueu la mostra al portaobjectes
Podeu utilitzar la tècnica de la tinció de Gram per ajudar a identificar bacteris en una mostra mèdica o un cultiu de bacteris que creixen en una placa de Petri. Per obtenir els millors resultats, utilitzeu la tinció de Gram en traços prims de la mostra. Es recomana utilitzar mostres de menys de 24 hores, ja que els bacteris més antics poden haver danyat les parets cel·lulars i no respondre a la tinció de Gram.
- Si utilitzeu una mostra de teixit, afegiu 1-2 gotes a un portaobjectes. Esteneu-lo uniformement sobre la diapositiva per formar una fina capa de mostra per aspersió, lliscant-la mitjançant la vora de l’altra diapositiva de vidre estèril. Deixeu-lo assecar abans de fer el següent pas.
- Si esteu prenent bacteris d'una placa de Petri, esterilitzeu el bucle d'inoculació en un cremador Bunsen fins que brille i deixeu-lo refredar. Utilitzeu el bucle per degotejar aigua estèril sobre el portaobjectes, després esterilitzeu-lo i refredeu-lo de nou abans d’utilitzar-lo per recollir una petita mostra de bacteris. Després, remeneu suaument.
- Els bacteris preparats al brou s’han de remenar de nou mitjançant un vòrtex, i després prendre’ls amb el bucle d’inoculació com s’ha indicat anteriorment, sense afegir aigua.
- Si teniu una mostra de hisop (normalment es fa amb un mànec petit de punta de cotó), toqueu i gireu suaument el hisop sobre la diapositiva.
Pas 4. Una temperatura lleugerament alta pot provocar un bon frotis
La calor mantindrà els bacteris a la part superior de la diapositiva, de manera que no es dissolguin fàcilment durant el procés de tinció. Toqueu la diapositiva ràpidament dues o tres vegades sobre un cremador Bunsen o escalfeu la diapositiva sobre un escalfador elèctric. No escalfeu massa, ja que la mostra es pot danyar. Si feu servir un cremador Bunsen, hauria de ser una flama petita però blava en lloc d’una flama taronja gran.
Alternativament, també es pot fer un frotis amb metanol afegint 1-2 gotes de metanol a un frotis sec, assecant el metanol restant a la diapositiva deixant-lo a l’aire lliure. Aquesta tècnica minimitza el dany de les cèl·lules i proporciona un fons net de la imatge de la diapositiva
Pas 5. Col·loqueu la diapositiva sobre la safata per pintar
Les safates de tinció estan fetes de plaques de metall, vidre o plàstic superficial amb una malla suau que revesteix la part superior. Col·loqueu les diapositives damunt d’aquestes xarxes, de manera que el líquid que utilitzeu es pugui escórrer a la safata.
Si no teniu cap safata per pintar, podeu col·locar una diapositiva sobre una safata de plàstic per imprimir glaçons
Mètode 2 de 3: procés de tinció de Gram
Pas 1. Aboqueu el líquid cristall violeta sobre el frotis
Feu servir una pipeta per ruixar una mostra de bacteris amb unes gotes de colorant violeta de cristall, també conegut com a violeta de genciana. Deixeu-ho durant 30-60 segons. El violeta cristal·lí (KV) se separa en solució aquosa en ions KV + i clorur (Cl-). Aquests ions penetren a les parets cel·lulars i a les membranes cel·lulars dels bacteris gram-positius i gram-negatius. L’ió KV + interactua amb els components carregats negativament de les cèl·lules bacterianes, donant a les cèl·lules un color morat.
Molts laboratoris utilitzen el cristall violeta "Hucker", que conté oxalat d'amoni per evitar la precipitació
Pas 2. Esbandiu el cristal violeta suaument
Inclineu el portaobjectes i utilitzeu una ampolla de rentadora per ruixar un petit raig d’aigua destil·lada o de l’aixeta sobre el portaobjectes. L'aigua hauria de baixar per sobre de la superfície del frotis i no s'hauria de ruixar directament sobre el frotis. No esbandiu excessivament. Pot eliminar les taques dels bacteris Gram positius.
Pas 3. Esbandiu el frotis amb iode i després esbandiu-lo
Utilitzeu un comptagotes per rentar el frotis amb iode. Deixeu-ho actuar durant 60 segons com a mínim i, a continuació, esbandiu-lo amb cura de la mateixa manera que l’anterior.) a les capes interiors i externes de la cèl·lula. Aquest complex de compostos conservarà el color violeta del cristall violeta a l'interior de la cèl·lula, en els llocs tacats.
El iode és una substància corrosiva. Eviteu la inhalació, ingestió o contacte amb la pell
Pas 4. Afegiu lleixiu de color i esbandiu-lo ràpidament
Normalment s’utilitza una barreja 1: 1 d’acetona i etanol per a aquest important pas, que s’ha de temporitzar amb cura. Col·loqueu la diapositiva amb un angle determinat i, a continuació, afegiu lleixiu de color fins que no quedi més porpra a l'aigua que s'utilitza per esbandir. Normalment triga menys de 10 segons, o fins i tot menys temps si el lleixiu conté una alta concentració d’acetona. Atureu aquest pas immediatament, en cas contrari, el colorant també lixiviarà el cristall violeta de les cèl·lules gram-positives i negatives i caldrà repetir el procés de tinció. Esbandiu immediatament l'excés de lleixiu de color amb la tècnica anterior.
- L’acetona pura (95% +) es pot utilitzar com a substitut. Com més acetona utilitzeu, més lleuger funcionarà el lleixiu, de manera que haureu de prestar més atenció al temps.
- Si teniu problemes per fer un seguiment del temps d’aquest pas, afegiu lleixiu de color gota a gota.
Pas 5. Escampeu el contracolorant sobre el frotis i, a continuació, esbandiu-lo
Una contra taca, generalment safranina o fucsina, s’utilitza per augmentar el contrast entre bacteris gram negatius i gram positius, tenyint bacteris decolorats (decolorats), és a dir, bacteris gram negatius, de color rosa o vermell. Deixeu-ho com a mínim 45 segons, després esbandida.
Fuchsin tacarà intensament molts bacteris gramnegatius, com Haemophilus spp i Legionella spp. Aquest mètode és bo per a principiants
Pas 6. Assecar la diapositiva
Podeu assecar-los a l'aire lliure per assecar-los o assecar-los amb paper bibulós venut amb aquesta finalitat. El procés de tinció de Gram s'ha completat.
Mètode 3 de 3: comprovació dels resultats del color
Pas 1. Prepareu el microscopi òptic
Col·loqueu la diapositiva sota el microscopi. Els bacteris varien molt en mida, de manera que l’augment total requerit variarà de 400x a 1000x. Es recomana un objectiu amb oli per immersió per obtenir una imatge més nítida. Deixeu caure l’oli d’immersió a la diapositiva, evitant moviments mentre degoteu per evitar que es formin bombolles. Mou la nansa de la lent del microscopi de manera que l’objectiu objectiu quedi al seu lloc i toqui l’oli.
La immersió en oli només es pot utilitzar en lents especialment dissenyades, no en lents "seques"
Pas 2. Intenteu identificar els bacteris gram positius i gram negatius
Examineu la diapositiva al microscopi òptic. Els bacteris gram positius apareixen de color porpra, perquè el cristall violeta queda atrapat dins de la gruixuda paret cel·lular. Els bacteris gramnegatius seran de color rosa o vermell, perquè el cristall violeta s’esbandeix a través de les primes parets cel·lulars, per on entra el contracolor rosa.
- Si la mostra és massa gruixuda, el resultat pot ser un fals positiu. Tinteu una nova mostra si mostra tots els bacteris gram positius, per assegurar-vos que el resultat sigui correcte.
- Si utilitzeu massa lleixiu de color, el resultat pot ser un fals negatiu. Tinteu una nova mostra si mostra tots els bacteris gram negatius, per assegurar-vos que el resultat sigui correcte.
Pas 3. Compareu els resultats que veieu amb la imatge de referència
Si no sabeu com són els bacteris, estudieu la col·lecció d'imatges de referència, generalment ordenades per forma i taca de Gram. També podeu veure bases de dades en línia a [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos i molts altres llocs en línia. Per facilitar la identificació, a continuació es mostren exemples de bacteris que solen trobar-se o que són importants per al diagnòstic, classificats segons el seu estat i forma de Gram.
Pas 4. Identifiqueu els bacteris gram-positius en funció de la seva forma
Els bacteris també es classifiquen segons la seva forma al microscopi, més comunament com cocos (esfèrics) o varetes (cilíndriques). Aquests són alguns exemples de bacteris gram-positius (de color porpra) segons la seva forma:
- Cocs gram positius generalment estafilococs (que significa grup de cocs) o estreptococs (que significa cocs de cadena).
- 'Varetes gram positives com Bacillus, Clostridium, Corynebacterium i Listeria. El bacteri de la barra Actinomyces spp. solen tenir branques o filaments.
Pas 5. Identifiqueu els bacteris gram negatius
Els bacteris gramnegatius (de color rosa) es classifiquen sovint en tres grups. Els cocos són de forma esfèrica, les varetes són llargues i primes, mentre que les coccoides es troben al mig.
- Cocs gram negatius El més comú és Neisseria spp.
- Varetes gramnegatives per exemple, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas i molts altres. Vibrio cholerae es pot veure com una tija regular o una tija doblegada.
- Els bacteris de la vareta "coccoide" (o "coccobacilli") gramnegatius per exemple, Bordetella, Brucella, Haemophilus i Pasteurella
Pas 6. Comproveu detingudament si els resultats són barrejats
Alguns bacteris són difícils de colorir amb precisió, a causa de la fragilitat o la naturalesa cerosa de les seves parets cel·lulars. Aquests bacteris poden mostrar una barreja de porpra o rosa a la mateixa cèl·lula o entre cèl·lules diferents en el mateix frotis. Les mostres bacterianes de més de 24 hores poden mostrar aquest problema, però també hi ha algunes espècies bacterianes que continuen sent difícils de colorar en qualsevol edat de presa de mostres. Aquests bacteris requereixen proves més especialitzades per identificar-les, com ara tincions àcides ràpides, observació en cultiu bacterià, mitjans de cultiu TSI o proves genètiques.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Propionibacterium spp. tots són bacteris gram-positius, però sovint no es tenyeixen clarament.
- Bactèries petites i primes com ara Treponema, Chlamydia i Rickettsia spp. difícil de tacar pel mètode Gram.
Pas 7. Eliminar la resta de consumibles i equips
Aquest procediment d’eliminació de residus varia entre laboratoris i depèn dels materials utilitzats. Normalment, el líquid de la safata de taca s’elimina en ampolles etiquetades com a residus perillosos. Remull les diapositives en una solució de lleixiu al 10% i, a continuació, llenceu-les en un contenidor per a objectes punxants.
Consells
- Recordeu que els resultats de la tinció de Gram només seran bons si la mostra és bona. És important informar els pacients perquè puguin proporcionar un bon exemplar (per exemple, la diferència entre escopir i tos profunda per obtenir una mostra d’espector).
- Com a lleixiu de color, l’etanol reacciona més lentament que l’acetona.
- Seguiu les normes de laboratori estàndard per garantir la seguretat.
- Utilitzeu un hisop de galta per practicar, ja que conté bacteris gram-positius i gram-negatius. Si només veieu un tipus de bacteri, és possible que utilitzeu massa lleixiu o massa.
- Podeu utilitzar tancaments de fusta per assegurar la diapositiva.
Advertiment
- L’acetona i l’etanol són substàncies inflamables. L’acetona eliminarà l’oli de les mans i facilitarà l’absorció d’altres productes químics per a la pell. Utilitzeu guants i utilitzeu-los amb cura.
- No deixeu que el frotis s’assequi abans d’esbandir la taca de Gram o el contracolor.
Què necessites
- Mostra de xarxa
- Tobogan de vidre
- Pipeta
- Font de foc petita o escalfador de lliscament o metanol
- Aigua
- Vidre violeta
- Iode
- Color de lleixiu, com l'alcohol o l'acetona
- Safranina
